Chityna, BBB, cholera

Główną przeszkodą w dostarczaniu leków do mózgu jest obecność bariery krew-mózg (BBB). BBB pozwala na wprowadzenie niezbędnych składników odżywczych przy jednoczesnym wykluczeniu szkodliwych substancji, w tym większości środków terapeutycznych; dlatego zaburzenia mózgu, zwłaszcza w jego nowotwory, są bardzo trudne do leczenia gdyż przeszkodą w dostarczaniu leków do mózgu jest obecność bariery krew-mózg (BBB).

Chitosan jest dobrze przebadanym polimerem, który oferuje korzystne właściwości biologiczne i chemiczne, takie jak mukoadhezja (przyleganie do błon śluzowych) i łatwość funkcjonalizacji (fizykochemicznej zmiany powierzchni chitosanu).

Nanonośniki na bazie chitosanu (ang. Chitosan Nano-Carriers / CsNC) ustanawiają interakcje jonowe z komórkami śródbłonka, ułatwiając przechodzenie leków przez BBB w procesie zwanym transcytozą. Proces ten dodatkowo wzmacniają modyfikacje struktury chitosanu, dzięki obecności reaktywnych grup np. aminowych (-NH2) czy hydroksylowych (-OH).

Wreszcie, dzięki trwałemu wiązaniu ligandów lub cząsteczek, takich jak przeciwciała lub lipidy, CsNC wykazały wzmocnione przejście przez BBB, w badaniach nowotworów in vivo, jak i in vitro.

BBB umożliwia pasywną dyfuzję poprzez transport trans-komórkowy tylko cząsteczek lipofilowych o masie cząsteczkowej (MW) do 600 Da (Daltonów) oraz transport para-komórkowy cząsteczek hydrofilowych o MW mniejszej niż 200 Da. Ponadto, aby przejść przez śródbłonek, cząsteczka musi zawierać mniej niż pięć donorów wiązań wodorowych i mniej niż dziesięć akceptorów wiązań wodorowych. Ostatecznie obliczona lipofilowość powinna być mniejsza niż pięć.

[Dalton lub zunifikowana atomowa jednostka masy (symbole: Da lub u – patrz niżej) to jednostka masy spoza układu SI, szeroko stosowana w fizyce i chemii. Jest zdefiniowany jako 1⁄12 masy niezwiązanego neutralnego atomu węgla ¹²C w jego jądrowym i elektronowym stanie podstawowym oraz w spoczynku. Stała masy atomowej, oznaczona mu, jest zdefiniowana wzorem mu = m(¹²C)/12 = 1 Da (Dalton).

Węgiel ¹²C jest najobficiej występującym z dwóch stabilnych izotopów węgla (drugim jest węgiel ¹³C), stanowiącym 98,93% pierwiastka węgla na Ziemi. Jego obfitość wynika z procesu „potrójnej alfa” przez który powstaje w gwiazdach (patrz niżej). Węgiel ¹²C ma szczególne znaczenie w jego zastosowaniu jako wzorzec masy, od którego mierzy się masy atomowe wszystkich nuklidów, dlatego masa atomowa węgla ¹²C z definicji wynosi dokładnie 12 Daltonów. Węgiel ¹²C składa się z 6 protonów, 6 neutronów i 6 elektronów (…)

Proces „potrójnej alfa” to łańcuch reakcji syntezy jądrowej, w którym trzy jądra helu ⁴He (cząstki alfa) są przekształcane w węgiel]

Tylko 2% małych cząsteczek może przekroczyć BBB, takich jak opiaty, anksjolityki i leki przeciwpsychotyczne. Prawie 100% makrocząsteczek, w tym antybiotyków i leków przeciwnowotworowych, nie jest w stanie dotrzeć do mózgu.

Tylko 5% z ponad 7000 leków zawartych w bazie danych Comprehensive Medicinal Chemistry (CMC) może leczyć zaburzenia neurologiczne, przede wszystkim depresję, schizofrenię i bezsenność. W rzeczywistości BBB jest wyposażona w pompy wypływowe (klasa kaset wiążących ATP (ABC), takie jak P-glikoproteiny-P-gp), które usuwają szkodliwe substancje i liczne terapeutyczne substancje czynne na zewnątrz mózgu, reprezentując główną przeszkodę w dostarczaniu leku do mózgu. Chitosan pochodzi z częściowej N-deacetylacji chityny w gorącym środowisku alkalicznym (lub przy pomocy enzymów m. in. wydzielanych przez mikroorganizmy flory bakteryjnej jelit), w wyniku czego powstaje ko-polimer składający się z jednostek N-acetylo-glukozaminy i N-glukozaminy połączonych wiązaniami β-(1’4)-glikozydowymi (Rysunek 2 przedstawia jego strukturę – poniżej).

Warunki reakcji jego wytwarzania determinują stopień deacetylacji (DDA) i masę  molekularną (MW) chitosanu. Dostępny w handlu chitosan ma DDA w zakresie 70–85%. Jest rozpuszczalny w rozcieńczonych kwaśnych roztworach, ale nierozpuszczalny w fizjologicznym pH. Polikationowe grupy aminowe nadają chitosanowi właściwości mukoadhezji, a mianowicie tworzenia oddziaływań jonowych z anionami na powierzchni komórki lub błonie śluzowej, co wydłuża czas przebywania w miejscu docelowym, zwiększając w ten sposób wchłanianie cohitosanu (oraz związanych z jego powierzchnią cząsteczek) przez błonę komórki. Protonowane grupy aminowe są również zaangażowane w tworzenie nano-cząstek przez żelowanie jonowe. Jest to szeroko stosowana technika. Opiera się ona na oddziaływaniach elektrostatycznych między dodatnimi ładunkami chitosanu i ujemnymi ładunkami nietoksycznego środka sieciującego, takiego jak np. tripolifosforan sodu (TPP). Grupy funkcyjne chitosanu (aminowe, pierwszorzędowe i drugorzędowe grupy hydroksylowe) umożliwiają szeroki zakres modyfikacji chemicznych, takich jak acylowanie, tosylowanie czy Okarboksymetylacja, a także funkcjonalizację [tak nazywa się dokonywanie określonej zmiany w strukturze i fizykochemicznych właściwościach danej nanocząsteczki] przeciwciałami, eterami lub lipidami.

Chityna jest obfitym źródłem węgla, azotu i energii dla mikroorganizmów morskich, a Vibrio cholerae [bakteria Cholery] jest typowym przedstawicielem różnorodnych ekosystemów wodnych na całym świecie. Oddziaływanie V. cholerae z chityną jest paradygmatycznym oddziaływaniem bakteria-substrat o złożonym i znaczącym wpływie na zwyczaje bakterii. Ponieważ chityna jest najobficiej występującym biopolimerem w środowisku wodnym (!), jej powiązanie z V. cholerae zapewniło bakteriom szereg korzyści, w tym dostępność pożywienia, adaptację do środowiskowych składników odżywczych, tolerancję na stres i ochronę przed drapieżnikami. Interakcje między V. cholerae a chityną zachodzą na wielu poziomach hierarchii w środowisku i obejmują reakcje metaboliczne i fizjologiczne komórek, np. chemotaksję, namnażanie komórek, indukcję kompetencji, tworzenie biofilmu, związek komensalny i symbiotyczny organizmów wyższych, obieg składników pokarmowych, a także patogeniczność dla ludzi i zwierząt wodnych.

Badania mutacji V. cholerae rosnącej na powierzchni chityny (!) lub w obecności rozpuszczalnych oligosacharydów chityny (GlcNAc)_2–6, GlcNAc lub dimeru glukozaminy (GlcN)₂ zidentyfikowały trzy zestawy różnie regulowanych genów. Wykazano, że biosensor chityny (ChiS) reguluje ekspresję zestawu genów metabolizujących (GlcNAc)_2–6, w tym operonu [biologiczna nazwa na zestaw genów współpracujących w ramach danego procesu fizjologicznego np. degradacji chityny] katabolicznego (GlcNAc)₂, dwóch zewnątrzkomórkowych chitynaz i chitoporyny. Pojawienie się GlcNAc powoduje skoordynowaną ekspresję genów zaangażowanych w chemotaksję i przyleganie [bakterii] do chityny oraz transport i asymilację GlcNAc. Z kolei dostępność (GlcN)₂ indukuje geny niezbędne do transportu i katabolizmu nieacetylowanych reszt chityny.

Jeden z takich genów, Dorsz, koduje deacetylazę oligosacharydu chitynowego, gdy komórki są indukowane przez chitobiozę (GlcNH₂)₂ lub surowe skorupy krabów. Ta deacetylaza jest wydzielana na wszystkich etapach wzrostu przez V. cholerae. Gen ten został sklonowany a białko oczyszczony wykazując że Dorsz jest praktycznie nieaktywna w obecności GlcNAc i umiarkowanie aktywna w obecności chityny koloidalnej. Jednak deacetylaza ta jest bardzo aktywna w obecności oligosacharydów chitynowych, które szybko zostają przekształcone przez tę deacetylazę w reszty chityny pozbawione jednej grupy acetylowej. Dane sekwencji Dorsz w banku genów pokazują, że enzym ten jest wysoce konserwatywny u bakterii z rodziny Vibrio i Photobacteria. Jeden taki gen koduje deacetylazę wyizolowaną z V. alginolyticus, która jest specyficzna dla (GlcNAc)₂, ale nieaktywna wobec dłuższych oligosacharydów. Produkty enzymatyczne chityny generowane przez te bakterie jak np. GlcNAcGlcNH₂-(GlcNAc)_n, bardzo przypominają te otrzymywane przez hydrolizę chitooligosacharydówjak np. GlcNH2-(GlcNAc)_3–4, które są kluczowymi półproduktami w biosyntezie czynników niezwykle ważnych w komunikacji między bakteriami i roślinami wiążącymi azot. Niewykluczone, że oligomery generowane przez deacetylazy odgrywają równie ważną rolę w komunikacji między komórkami bakterii i gospodarzy.

O tym czy dotyczy to także człowieka… praktycznie nic nie wiadomo.

Komentarz:

Istnieją zatem przesłanki do spekulowania [ponieważ konkretnych badań tego zagadnienia jeszcze nie ma], że spożywanie chityny może prowadzić do generowania różnych form chitosanu w jelitach a ten powstając może przyczyniać się do transportowania przez błony śluzowe i barierę krew-mózg nie tylko nano-, micro- i makrocząsteczek w tym RNA, DNA, białek ale i wirusów oraz przede wszystkim żywych bakterii takich jak np. bakterii Cholery. Stanowi to potencjalne ryzyko nasilenia infekcji wirusowo-bakteryjnych oraz transfekcji komórek gospodarza np. komórek jelit ale i samego mózgu różnymi kwasami nukleinowymi obecnymi w środowisku jelit i generowanymi przez żyjące tam bakterie (np. lncRNA czy circRNA/DNA). Może to mieć znaczący wpływ na choroby nowotworowe jelit i inne procesy patogenne organizmu ludzkiego. Jakie – dokładnie nie wiadomo na tym etapie tego nowego eksperymentu na ludzkości.

Jan Kanda

Literatura:

• Caprifico AE, Foot PJS, Polycarpou E, Calabrese G. Overcoming the Blood-Brain Barrier: Functionalised Chitosan Nanocarriers. Pharmaceutics. 2020 Oct 23;12(11):1013. doi: 10.3390/ pharmaceutics12111013. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7690755/
• Zhao Y, Park RD, Muzzarelli RA. Chitin deacetylases: properties and applications. Mar Drugs. 2010 Jan 14;8(1):24-46. doi: 10.3390/md8010024.
  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/ PMC2817921/
• Kadiyala I, Loo Y, Roy K, Rice J, Leong KW. Transport of chitosan-DNA nanoparticles in human intestinal M-cell model versus normal intestinal enterocytes. Eur J Pharm Sci. 2010 Jan 31;39(1-3):103-9. doi: 10.1016/j.ejps.2009.11.002. Epub 2009 Nov 12.
  https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2818464/

Literatura dodatkowa:

• Fan S, Xing J, Jiang Z, Zhang Z, Zhang H, Wang D, Tang D. Effects of Long Non-Coding RNAs Induced by the Gut Microbiome on Regulating the Development of Colorectal Cancer. Cancers (Basel). 2022 Nov 25;14(23):5813. doi: 10.3390/cancers14235813. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pmc/articles/PMC9735521/
• Zhu Z, Huang J, Li X, Xing J, Chen Q, Liu R, Hua F, Qiu Z, Song Y, Bai C, Mo YY, Zhang Z. Gut microbiota regulate tumor metastasis via circRNA/miRNA networks. Gut Microbes. 2020 Nov 9;12(1):1788891. doi: 10.1080/19490976.2020.1788891. Epub 2020 Jul 18.
  https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7524358/