2 x 72 = 30%

Jednym z etapów ograniczających skuteczność transfekcji [dostarczania obcego materiału genetycznego do komórek] w dostarczaniu genów niewirusowych jest nieefektywny import jądrowy plazmidowego DNA [takiego DNA, które zanieczyszcza preparaty mmRNA firmy Pfizer/BioNTech] po jego dostarczeniu do cytoplazmy.

Poprzez mikroiniekcję do cytoplazmy…
[istnieje stara technika biologii molekularnej, która pozwala na nastrzykiwanie – dosłownie – igłą szklaną pojedynczych komórek. Robi się to tak, że kulturę komórek na płytce stawia się pod mikroskopem świetlnym podłączonym do kamery i komputera sterującego igłą zawierającą materiał genetyczny, który chcemy podać do komórki. Oprogramowanie komputera pozwala poprzez obraz z kamery wybrać pojedyncze komórki które chcemy nastrzyknąć, a komputer odpowiednio ustawia igłę poprzez jej mikro-ruchy, dokonując iniekcji]
… i hybrydyzację in situ [w żywej komórce] w kilku typach komórek, wykazano, że region regulatorowy małpiego wirusa 40 (ang. Simian Virus SV40), … [Małpi wirus poliomawirusa 40 (SV40) jest znanym onkogennym wirusem DNA, który wywołuje pierwotne nowotwory mózgu i kości, międzybłoniaka złośliwego i chłoniaki u zwierząt laboratoryjnych. SV40 powoduje także infekcje u ludzi i stanowi nowy patogen. Meta-analiza danych molekularnych, patologicznych i klinicznych od 1793 pacjentów chorych na raka wskazuje, że istnieje znaczne zwiększone ryzyko SV40 związane z pierwotnymi nowotworami mózgu u ludzi, pierwotnymi nowotworami kości, międzybłoniakiem złośliwym i chłoniakiem nieziarniczym. Dane eksperymentalne zdecydowanie sugerują, że SV40 może mieć funkcjonalne znaczenie w rozwoju niektórych z tych ludzkich nowotworów złośliwych. Dlatego też główne typy nowotworów wywołanych przez SV40 u zwierząt laboratoryjnych są takie same, jak nowotwory u ludzi, w przypadku których stwierdzono obecność markerów SV40. Patrz: literatura dodatkowa]
… w szczególności fragment genomowego DNA SV40 o długości ok. 372 bp, obejmujący promotor-wzmacniacz SV40 posiadający tzw. replikation ori czyli sekwencje inicjujące replikację genomu wirusa [również zwane w skrócie: SV40 DTS czyli DNA „Nuklearne” Targeting Sequences, tj. sekwencje DNA rozpoznawane przez endogenne białka wiążących DNA], mógłby umożliwić import jądrowy plazmidu (DNA) niosącego te sekwencje. [czyli takiego jaki występuje w zanieczyszczeniach preparatów mmRNA firmy Pfizer/BioNTech]
Ekspresja genów z konstruktów plazmidowych niosących SV40 DTS różni się w zależności od typu komórki i użytego konstruktu plazmidowego. Taka zależność ekspresji genów z plazmidów zawierających SV40 DTS od typu komórki jak i konstrukcji samego plazmidu sugeruje, że ekspresja genu z plazmidów [w przypadku plDNA w preparatach mmRNA – jest to zarówno gen kodujący białko Kolca ale także geny odporności na antybiotyki zawarte w tym plazmidowym DNA] nie jest całkowicie zależna od jego zdolności do zwiększania importu jądrowego wspomnianych plazmidów.

W przypadku niewirusowego dostarczania genu, aby osiągnąć skuteczne dostarczanie genu, należy pokonać trzy główne bariery komórkowe. Najpierw DNA powinno przejść przez błonę plazmatyczną, a następnie wydostać się z błony endosomalnej.
[Jest to błona otaczająca pobrane przez komórkę DNA lub błona nanoliposomu jak w przypadku preparatów mmRNA, którą otoczono mmRNA i zanieczyszczające plDNA. Błona ta powinna się zintegrować z błoną komórki w czasie interakcji nanoliposomu zawierającego RNA/DNA z błoną komórki ale czasami będzie pobierana w całości lub fragmentach do komórki gdzie może być dodatkowo otoczona przez błonę endosomu. Wtedy wydostanie się RNA/DNA polegałoby na pokonaniu dwóch błon – nanoliposomu i endosomu. To byłaby rzadka sytuacja ale możliwa. Najczęściej jednak RNA/DNA podawane w nanoliposomach od razu znajduje się w cytoplazmie komórki po połączeniu się błony nanoliposomu z błoną komórki – plazmalemmą – i „wlaniu” zawartości nanoliposomu do wnętrza komórki – cytoplazmy gdzie nagła zmiana warunków jonowych środowiska powoduje dysocjację – uwolnienie RNA/DNA od polikationowego rusztowania z modyfikowanego PEG i dalsze procesy molekularne takie jak translacja w przypadku mmRNA i przejście do jądra komórki w przypadku plazmidowego DNA i/lub jego fragmentów]

Po trzecie, powinien przejść przez błonę jądrową. Ostatni etap, nazywany importem jądrowym, jest niezbędny, aby gen wszedł w kontakt z maszynerią transkrypcyjną komórki, co z kolei jest niezbędne do ekspresji tego genu [zawartego w plazmidowym DNA, nie w mmRNA].
Uważa się, że skuteczność importu jądrowego plazmidu jest ważnym i ściśle regulowanym [a prze to ograniczanym] molekularnym zdarzeniem kinetycznym, które wpływa na ekspresję transgeniczną w komórkach eukariotycznych.
[Jest to prawdopodobne ponieważ jak wiemy z wniosków zawartych w tej pracy ten sam plazmidowy DNA jest inaczej pobierany i eksprymowany w zależności od typu komórek do których został podany]
Uważa się także, że transfekcje za pośrednictwem wirusów są bardziej wydajne ze względu na zdolność białek wirusowych do przekraczania błony jądrowej. [Dlatego nie należy zapominać o osobach zaszczepionych adenowektorowym DNA o którym wiadomo, że lokalizuje do jądra komórki i integruje się z DNA jądrowym – patrz literatura dodatkowa].

Jednakże w przypadku niewirusowego dostarczania genów import jądrowy nie jest wspomagany, a poziom uzyskanej ekspresji transgenicznej jest stosunkowo drastycznie zmniejszony.
Jednakże istnieją metody pozwalające na zwiększenie importu plazmidowego DNA do jądra komórki, które polegają na przyłączeniu sekwencji znanej jako NLS [ang. Nuclear Leading Sequence] do DNA. Sekwencja NLS, zwykle występuje w przypadku białek przemieszczających się przez błonę jądrową w NPC [ang. Nuclear Pore Complex].
Białka zawierające NLS są transportowane do jądra poprzez interakcję z jednym lub większą liczbą receptorów NLS zwanych importynami lub kariofirynami.

Badając te białka regulujące transport do jądra komórki – wykazano także, że istnieją pewne sekwencje DNA, które pomagają w imporcie jądrowym plazmidowego DNA, gdy ten znajdzie się w cytoplazmie.
Przykładowo kiedy plazmid zawierający sekwencję oriP wirusa EBV transfekowano do komórek stabilnie eksprymujących białko EBNA1, nastąpił aż do 100-krotny wzrost ekspresji lucyferazy [fluorescencyjny gen reporterowy używany w badaniach molekularnych do analizy aktywności np. ekspresji białka z danego genu]. To wzmocnienie ekspresji genów przypisano zwiększonej wydajności importu DNA do jądra po związaniu z EBNA1 zawierającym NLS.

Z kolei dostarczanie DNA ze zmodyfikowanym białkiem GAL4, które jest czynnikiem transkrypcyjnym działającym w jądrze komórki gdzie musi zostać przetransportowane z cytoplazmy, może również skutecznie transportować DNA do jądra. W tym przypadku, NLS zapewniany przez GAL4 pomaga w przenoszeniu DNA przez pory jądrowe.
Wykazano również, że włączenie sekwencji czynnika transkrypcji NFkB zwiększa wychwyt jądrowy plazmidowego DNA po indukcji induktorem, TNFα lub TPA.
[Tissue Plasminogen Activator / Jest to o tyle ciekawe, że białko Kolca silnie aktywuje czynnik NFkB jak i TNFα. Z kolei podjednostka S1 białka Kolca SARS-CoV-2, wiąże się z fibrynogenem i indukuje strukturalnie nieprawidłowe skrzepy krwi o zwiększonej aktywności prozapalnej i oporności na fibrynolizę przy czym TPA przyłącza się do fibryny na powierzchni skrzepu. Aktywuje plazminogen związany z fibryną. Plazmina jest następnie odcinana od plazminogenu związanego z fibryną. Plazmina rozbija cząsteczki fibryny, a skrzep rozpuszcza się, co w przypadku obecności białka S (Kolca) nie może zajść gdyż białko to blokuje oporność na fibrynolizę]
W późniejszych badaniach wykazano, że region DNA SV40 ma wyjątkową zdolność do aktywnego transportu plazmidów z cytoplazmy do jądra. Region ten nazywany jest DTS i ma długość ok. 372 pz [par zasad / a języku ang. bp od base pairs]. Ta sekwencja pomaga w imporcie jądrowym plazmidów w różnych typach komórek po wstrzyknięciu wolnego od białka DNA i wykryciu go poprzez hybrydyzację in situ.

Region SV40 obejmuje wczesne i późne promotory SV40 wraz z dwoma powtórzeniami tzw. wzmacniacza [ ang. enhancer] o długości 72 bp zawierającym miejsce  początku replikacji DNA [ori od ang. origin].
Chociaż wykazano, że ta pełnej długości sekwencja jest tak samo skuteczna jak cały genomowy DNA SV40 w transporcie plazmidu do jądra, stwierdzono, że również tylko pojedyncze powtórzenie o długości 72 bp zachowuje funkcję związaną z importem plazmidowego DNA do jądra komórki.
[a więc nie cały region promotora SV40 musi być obecny w jakimkolwiek plazmidowym DNA (plDNA) aby taki plDNA został przetransportowany do jądra komórki – wystarczy jedno powtórzenie o dł. 72 bp].
Wykazano również, że DTS SV40 posiada niezależną od orientacji i pozycji w ramach plazmidowego DNA funkcję importu jądrowego, a także wykazano, że zwiększa ekspresję genu w tkance mięśniowej [!! do której głównie podawano preparaty mmRNA a tym samym w sercu gdzie jak wiadomo z ostatniej pracy – patrz: literatura dodatkowa, praca podkreślona –  preparaty mmRNA muszą gromadzić się preferencyjnie w komórkach mięśnia serca, które jest uszkodzone u ok. 1.35x więcej osób po przyjęciu przez nie preparatów mmRNA] i kilku innych typach komórek.

Z danych opublikowanych przez Kevin McKernan, Yvonne Helbert, Liam T. Kane, Stephen McLaughlin (Medicinal Genomics, 100 Cummings Center, Suite 406-L, Beverly Mass, 01915, USA) wszystkie wektory firmy Pfizer zawierają wzmacniacz SV40 w dwóch kopiach, o wielkości 72 bp związane z silniejszą ekspresją i lokalizacją jądrową. [patrz: załącznik]

Źródło:
Sequencing of bivalent Moderna and Pfizer mRNA vaccines reveals nanogram to microgram quantities of expression vector dsDNA per dose.
https://cdn-ceo-ca.s3.amazonaws.com/1i4tp3q-Sequencing%20of%20bivalent_4-11-23.pdf
—-
Komentarz:
A zatem preparaty mmRNA zawierajace zanieczyszczenie plazmidowym DNA (plDNA), w którym znajdują się aż dwa powtórzenia promotora (wzmacniacza) SV40, posiada wyjątkowo silną zdolność do akumulowania tego plDNA w jądrze komórek szczególnie mięśni w tym mięśnia serca gdzie jak już wimy preparaty mmRNA gromadzą się preferencyjnie i gdzie nawet sam promotor SV40 powoduje bardziej wydają ekspresję genów zawartych w plDNA czyli głównie genu białka Kolca, którego podjednostka S1 blokuje także proces fibrynolizy skrzepów i przyczynia się do powstania zapalenia mięśnia serca, które jest śmiertelne w przypadku 70% osób dotkniętych tym zapaleniem po okresie 5 lat od jego wystąpienia i w ok. 80% po okresie 10 lat. Nie jest zatem wykluczone, że oprócz efektów związanych z zaburzeniem struktury i funkcji genomu komórek, w których doszło do lokalizacji jądrowej plDNA z preparatów mmRNA takich jak przykładowo nietypowe nowotwory – u osób które przyjęły szczególnie preparaty mmRNA firmy Pfizer może dojść do wysokiej i stałej produkcji białka S w mięśniach w tym w sercu co może się wiązać z olbrzymim wzrostem ryzyka wystąpienia oprócz nowotworów także zakrzepów i zapalenia mięśnia serca co ewentualnie zakończy się zgonem w ciągu max. 5-10 lat.

Spekulacje:
2 x 72 bp sekwencje wzmacniacza SV40 = 1.35x więcej osób z uszkodzonym sercem. Innymi słowy na każdą niezaszczepioną osobę przypada 0.35 osoby zaszczepionej z uszkodzonym sercem czyli na milion niezaszczepionych będzie 350 000 zaszczepionych z uszkodzonym sercem co daje 22 637 800 zaszczepionych osób w Polsce / 350 000 = 64. Innymi słowy 64 x 0.70% = 45 czyli po 6 latach od zaszczepienia w Polsce umrze co 45 zaszczepiona osoba tylko na powikłania związane z poszczepiennym uszkodzeniem mięśnia sercowego czyli 22 637 800 / 45 = 503 062 osób w ramach nadmiarowych zgonów. Oprócz tego będą zgony związane z wystąpieniam chorób nowotworowych, autoimmunologicznych, i neurodegeneracyjnych. W Polsce średnio. umierało ok. 366 tys. osób rocznie więc jeśli dodamy tylko spodziewane zgodny z powodu uszkodzenia serca otrzymamy dzieląc 503 062 / 6 = 83 843 rocznie + średnia z poprzednich lat i ostatnich lat „pandemii” kiedy liczba zgonów wzrosła znacznie do ok. 519 tys. czyli ([366 + 519]/2) = 442 tys. otrzymujemy ostatecznie 442 tys. (spodziewana średnia z poprzednich lat powiększona o zgony z powodu innych niż uszkodzenie serca chorób będących wynikiem działania preparatów mmRNA) + 83 843 (zgony rocznie z powodu uszkodzenia serca preparatami mmRNA) = 525 843 zgonów rocznie czyli w porównaniu do średnie z lat przed „pandemią” (366 tys.) będzie to spodziewany wzrost zgonów o ok. 30% czyli tak jak od dawna przewidywaliśmy – 30% osób więcej umrze w ciągu kolejnych 5 lat z powodu przyjęcia preparatów mmRNA. Można nawet spekulować, że skoro 70% ludzkości zostało zaszczepione to 30% z tych 70% umrze wciągu kolejnych 5 lat czyli jeśli 70% = 5.5 miliarda, to 30% = 5.5 x 0.30 = 1.65 miliarda. Nie jest wykluczone, że tyle ludzi więcej umrze na Ziemi do 2030 roku i … agenda 2030 zostanie zrealizowana… ?

Literatura:

Prasad TK, Rao NM. The role of plasmid constructs containing the SV40 DNA nuclear-targeting sequence in cationic lipid-mediated DNA delivery. Cell Mol Biol Lett. 2005;10(2):203-15. PMID: 16010286. 
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16010286/

Literatura dodatkowa:
Vilchez RA, Butel JS. Emergent human pathogen simian virus 40 and its role in cancer. Clin Microbiol Rev. 2004 Jul;17(3):495-508, table of contents. doi: 10.1128/CMR.17.3.495-508.2004.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC452549/

Stephen SL, Montini E, Sivanandam VG, Al-Dhalimy M, Kestler HA, Finegold M, Grompe M, Kochanek S. Chromosomal integration of adenoviral vector DNA in vivo. J Virol. 2010 Oct;84(19):9987-94. doi: 10.1128/JVI.00751-10. Epub 2010 Aug 4.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2937808/

Toomer et al. 2023. SARS-CoV-2 infection results in upregulation of Plasminogen Activator Inhibitor-1 and Neuroserpin in the lungs, and an increase in fibrinolysis inhibitors associated with disease severity. eJHaem. Volume4, Issue2. May 2023. Pages 324-338. 
https://doi.org/10.1002/jha2.654

Nakahara et al. Assessment of Myocardial 18F-FDG Uptake at PET/CT in Asymptomatic SARS-CoV-2-vaccinated and Nonvaccinated Patients. Radiology. Vol. 308, No. 3. Sep 19 2023. 
https://doi.org/10.1148/radiol.230743

—
Grupa Pradma